但是，围绕发酵本质的斗争并未结束。1878年，在著名生理学家贝尔纳逝世后， 法国科学界的一些人又找出他的一篇未完成的著作，反对巴斯德的发酵理论。贝尔 纳生前曾高度赞赏巴氏的此项理论，可是在他的遗著中却提出，是葡萄汁变为酒。 为了回签亡友的指责，巴斯德又设计了一项精心的实验，证明了不与酵母接触的葡 萄汁是不能变成酒的。
“微生物也母体”理论的提出和自然发生论者的抵制
千百年来，普遍流行着一种所谓“自然发生说”。该学说认为，不洁的衣物会 自生蚤虱，污秽的死水会自生蚊蚋，肮脏的垃圾会自生虫蚁，粪便和腐败的尸体会 自生蝇蛆。总之生物可以从它们存在的物质元素中自然发生，而没有上代，古希腊 学者亚里斯多德，中世纪神学家阿奎那，甚至连17世纪的大科学家哈维和牛顿，都 相信这种学说。有些过于执着的自生论者，例如17世纪的比利时化学家、医生范． 赫尔蒙脱，甚至想入非非地提出了“创造大老鼠”的方法。
意大利医生雷地于1668年进行的实验以及其他一些科学家的反复验证，曾一度 动摇了人们对自然发生论的信念。可是当后来发现了微生物时，很多科学家又相信 至少像微生物这样“最小的”生物体总该是自生的。加罩容器中的腐肉不是长满了 细菌吗！于是，微生物可能自然发生的信念又盛行起来。
巴斯德根据自己的研究实践，不相信微生物可以自然发生，认为微生物肯定必 有母体。他到宣传这一理论。这下子可激怒了自生论者。他们问巴斯德：“酵母怎 在地球的每一个角落里，在每一世纪的每一年里，不知道从什么地方出现，把葡萄 汁酿成酒？这些从天南地北，处处把每个罐里的牛奶变酸，每瓶里的牛油变坏的小 动物，来自什么地方？”
为了回答这些挑战，巴斯德重做了斯帕兰扎尼的实验。他在圆瓶里灌进一些酵 母汤，把瓶颈焊封，煮沸几分钟后搁置适当时间。结果表明，瓶里并没有微生物生 长。
这一试验并不能彻底驳倒自生论者。他们坐在巴斯德的书房里吵吵闹闹：“你 在煮沸酵母汤时，把瓶里的空气加热了。酵母汤产生小动物所需要的是自然的空气。 你不能把酵母汤和天然的未经加热的空气放在一起而不产生酵母、霉菌、杆菌或小 动物！”
面对对方的指责，巴斯德冥思苦想，决心设计一种只让天然空气进入而不许其 中的微生物进入的仪器。在老教授巴拉的指导下，巴斯德终于设计、制作出了符合 这一要求的仪器，即著名的曲颈瓶。实验取得了完全的成功。他喜不自胜。在一个 有学者、才子、艺术家争相参加的巴黎盛会上，巴斯德讲述了他的曲颈瓶试验，高 声宣布：“自然发生学说，经过这简单实验的致命一击之后，绝不能再爬起来了”。
接着，巴斯德又创造性地做了一次大规模的、半公开的实验。他和助手们将煮 过的装有细菌培养液的烧瓶分放在多尘的市区、巴黎天文台的地窖里和其他环境中 打开。发现空气越是不洁，培养液变质就越快、越严重。这说明使培养液变质的细 菌不是自生的，而是来自空气。他推测，海拔越高，空气一定越洁净，培养液受细 菌的污染也越轻微。为了验证这一点，他和助手们又先后登上汝拉山区的浦佩山， 爬上瑞士的勃朗峰，进行实验。结果，猜想得到了证实。
巴斯德向科学界报告了自己的实验结果。许多听众无不为他们的冒险献身所感 动，为他们的证据所折服。可是坚持自然发生说的反对派仍继续起劲地谴责巴斯德， 称他是“马戏团的演员、骗子和小丑”。攻击得特别凶的是博物学家布歇（Pouch- et，一译浦舍）等人。他们还采用以巴斯德之矛攻巴斯德之盾的办法，在一些瓶子 里灌进干草浸液而不是酵母汤，并造成真空，赶往比利牛斯山脉的高山玛拉得塔， 登上了比勃朗峰还要高出几英尺的山巅，打开瓶口。由于他们采用的是干草浸液， 加之没有加热，结果在瓶中发现了微生物。借此，布歇攻击巴斯德是“以自己的瓶 子作为对科学的最后通牒而惊世骇人”，要求在科学院作公开试验，而且说，如果 他们的瓶子有一个打开之后而不立刻生长微生物的话，他们愿意承认错误。